标签：Megazyme试剂盒

1. 简介：

膳食纤维是指碳水化合物及其相类似物质的总和，包括多糖、寡糖、木质素以及相关的植物物质。主要有纤维素、半纤维素、果胶及亲水胶体物质，如树胶、海藻多糖等组分；另外还包括植物细胞壁中所含有的木质素；不被人体消化酶所分解的物质，如抗性淀粉、抗性糊精、抗性低聚糖、改性纤维素、黏质、寡糖以及少量相关成分，如蜡纸、角质、软木脂等。
总膳食纤维检测试剂盒是根据AOAC991.43，AOAC 985.29，AACC32-07和AACC 32-05方法开发的，也适用于其它方法，如AACC Method 32-21，AACC method32-06。

2. 检测原理

脱脂（如大于10%）干燥后的样品经热稳定a-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解消化，酶解液通过乙醇沉淀、过滤，乙醇和丙酮洗涤残渣后干燥、称重，得到总膳食纤维（TDF）残渣；
酶解液通过直接过滤、热水洗涤残渣，干燥后称重，得到不溶性膳食纤维（IDF）残渣；
滤液用乙醇沉淀，过滤、干燥、称重，得到可溶性膳食纤维（SDF）残渣。
TDF、IDF和SDF的残渣扣除蛋白质、灰分和空白即得TDF、IDF和SDF含量。
该检测试剂盒的主要优势在于直接提供高纯度的酶，酶的活力是标准化的，而标准化的a-淀粉酶的活力在测量抗性淀粉是公认的。
淀粉葡萄糖苷酶中基本没有纤维素酶，而其他常用的酶制剂中常含有这种污染物，这将导致溶解和低估β-葡聚糖。
该试剂盒提供的酶都是稳定的液体，可以保存到试剂盒有效期，并且是直接应用液，不需要使用前再溶解。

3. 用途

适用于检测谷物、水果、蔬菜和加工食品中的总膳食纤维（TDF）、不溶性
膳食纤维（IDF）和可溶性膳食纤维（SDF）的检测。

4. 提供试剂及材料

每一个盒中的提供的酶试剂足够进行200个试验，如另外需要可单独订货：
Bottle 1 ，1瓶：
热稳定a-淀粉酶（20mL，~ 3,000 U/mL，Ceralpha method；~ 10,000 U/mL on
soluble starch。).
Bottle 2，1瓶：
纯化的蛋白酶(20mL，50 mg/mL; ~ 350 tyrosine Units/mL。)
Bottle 3，2瓶:
淀粉葡萄糖苷酶(20mL，3300 U/mL on soluble starch。)
总计：80ml（4瓶20ml包装）
另外，实验中需要用到硅藻土需要单独购买。
其他相关试剂盒：
膳食纤维质控试剂盒（货号：K-TSCK）
质控试剂盒用于检验酶的效力和纯度，含下表中所列物质每种一瓶，并附有技术数据单(K-TSCK)，盒中每种物质足够10次测试用。

5. 需要的设备和试剂

5.1 设备

1. 高型无导流口烧杯：400mL或600mL
2. 坩埚：具粗面烧结玻璃板，孔径40-60 μm。清洗后在马福炉中525℃灰化6小时或过夜，用真空泵除去硅藻土和灰分，室温下用2%清洗液浸泡1小时，用水和蒸馏水冲洗干净，用15 mL丙酮冲洗后风干，加1g硅藻土到干燥的坩埚中，在130℃干燥至恒重，在干燥器中冷却1小时，记下坩埚（包括硅藻土）的重量。
3. 真空溶剂过滤装置：真空泵或有调节装置的抽吸器，1L的抽滤瓶，侧壁有抽滤口，以及抽滤瓶配套的橡胶塞。用于酶解液的抽滤。
4. 恒温振荡水浴：95-100℃
5. 分析天平：感量0.1mg
6. 天平（台秤）：4 000g量程，感量0.1g
7. 马福炉：525±5°C，
8. 烘箱：103±2℃，130±3℃
9. 真空干燥箱
10. 干燥器：二氧化硅或等同干燥剂
11. PH计，具有温度补偿功能。
12. 微量凯氏定氮仪。
13. 移液器，50-200 μL，5 mL，一次性移液吸头。
14. 计时器。
15. 橡胶刮勺
16. 磁力搅拌器

5.2 试剂

1. 95%乙醇（体积比），
2. 78 %乙醇：取821mL95%乙醇置于容量瓶中，用水稀释到刻度，混匀。
3. 丙酮
4. 蒸馏水或去离子水
5. 清洗液Micro (International Products Corp.,Trenton,NJ).，配成2%液体
6. MES/TRIS缓冲液（0.05mol/L）:称取19.52g (MES) (Sigma, M 8250)和14.2 g

(TRIS) (Sigma,T1503)，用1.7L蒸馏水溶解，用6mol/L氢氧化钠调节PH至
8.2±0.1，加水稀释到2L（注意24℃时PH值为8.2，20℃时PH值为8.3，27-28℃
时PH值为8.1）

1. 盐酸溶液（0.561 mol/L）：取93.5mL 6 mol/L的盐酸，加入700mL水中，混匀

后用水定容到1L。

1. 氢氧化钠
2. PH值标准缓冲液：PH值为 4.0，7.0 和10.0。

6. 酶的纯化和标准化

6.1 根据AACC/AOAC的膳食纤维检测方法，必须确保酶的纯度。
6.1.1 淀粉葡萄糖苷酶被木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶污染，会低估β-葡聚糖、
阿拉伯木聚糖和果胶的含量。
6.1.2 热稳定a-淀粉酶被污染，会影响抗性淀粉的测量。
6.1.3 蛋白酶被4-β-葡聚糖酶污染，会低估β-葡聚糖的含量。
6.1.4 如不是使用该酶，请参考下面方法测定。

注解：
『1』：没有酶活力作用。
『2』：最大酶活力作用
『3』：除很少量的柑橘果胶全部沉淀
『4』：含有大量抗性淀粉，准确回收率的数值影响热稳定a-淀粉酶的使用量。
6.2 根据AACC/AOAC的膳食纤维检测方法，必须对酶标准化测定，如果不是使用该的酶，请按以下方法测定
6.2.1 淀粉葡萄糖苷酶，0.2 mL，
— 酶活力表示方法1：淀粉/葡萄糖酶-过氧化物酶法，3300 U/mL，1个酶活力单位定义为：40°C，PH值4.5时，每分钟释放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。
— 酶活力表示方法2：对-硝基苯基-b-麦芽糖苷（PNPBM)法，200 U/mL， 1个酶活力单位（1PNP单位））定义为：40°C，有过量萄糖苷酶存在下，每分钟从对硝基苯基-β-麦芽糖苷释放1 μmol 对硝基苯基所需要的酶量。
6.2.2 热稳定a-淀粉酶，0.05 mL，
— 酶活力表示方法1：以淀粉为底物，以Nelson/Somogyi还原糖表示，10000U/mL ，1个酶活力单位定义为：40°C，PH值6.5时，每分钟释放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。
— 酶活力表示方法2：对硝基苯基麦芽糖为底物，3,000 U/mL（Ceralpha），1个酶活力单位定义为：40°C，PH值6.5时，每分钟释放1 μmol对-硝基苯基所需要的酶量。
6.2.3 蛋白酶，0.10 mL
— 酶活力表示方法1：酪蛋白测试，350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine U/mL，1个酶活力单位定义为：40°C，PH值8.0时，每分钟从可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯乙酸）1 μmol酪氨酸所需要的酶量。
— 酶活力表示方法2：偶氮酪蛋白测试，350 U/mL或50 mg/mL或7 Tyrosine U/mL，1个内肽酶活力单位定义为：40°C，PH值8.0时，每分钟从可溶性酪蛋白中水解出（并溶于三氯乙酸）1μmol酪氨酸所需要的酶量。该偶氮酪蛋白(货号：S-AZCAS).
 

7. 检测步骤

7.1 试样制备
准确称取双份试样各1 g，质量差小于0.005g，精确到0.1mg，置于400mL或600mL高型烧杯中，同时制备双份空白样，在每个烧杯中加入40 mL PH值8.2的MES-TRIS缓冲液，磁力搅拌，直到试样完全分散到缓冲液中。
7.2 热稳定a-淀粉酶酶解：加入50 μL热稳定a-淀粉酶溶液，加盖铝箔，置于95-100°C恒温振荡水浴中持续振摇，当所有烧杯全部放入水浴开始计时，反应35分钟。
7.3 冷却：将烧杯取出玲却到60°C，除去铝箔盖，用刮勺将烧杯内壁和底部的胶状物刮下，用10 mL蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。
7.4 蛋白酶酶解：在每个烧杯中各加入100 μL蛋白酶溶液，加盖铝箔，置于60°C恒振荡水浴中，当烧杯内温度达到60°C开始计时，持续反应30分钟。
7.5 PH值调节：反应30分钟后，边搅拌边加入0.561 mol/L盐酸，严格控制60°C，用 1mol/L氢氧化钠溶液或 1mol/L盐酸溶液，控制PH值在4.5±0.2。
7.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解：在上述溶液中边搅拌边加入200 μL淀粉葡萄糖苷酶溶液，加盖铝箔，置于60°C恒温振荡水浴中，持续振摇，当烧杯内温度达到60°C开始计时，反应30分钟。

8. 测定

8.1 不溶性膳食纤维测定：
8.1.1 过滤洗涤：试样酶解液全部转移到坩埚中过滤，残渣用10mL预热到70°C的蒸馏水洗涤两次，合并过滤液，转移至另一600mL高脚烧杯中，备测可溶性膳食纤维。残渣分别用10mL 95%乙醇和丙酮洗涤两次，抽滤去除洗涤液，将坩埚连同残渣在103°C烘干过夜，将坩埚置于干燥器中冷却1小时，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土），精确至0.1mg，减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。
8.1.2 蛋白质和灰分测定：称完质量的残渣和硅藻土的混合物，一份用凯氏定氮法，以N×6.25为换算系数，计算蛋白质质量。另一份在525°C灰化5小时，于干燥器中冷却，精确称量坩埚总量（精确至0.1mg）减去坩埚和硅藻土干重，计算灰分质量。
8.2 可溶性膳食纤维测定
8.2.1 计算滤液体积：将不可溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600mL的高型烧杯中，通过烧杯+滤液总重扣除烧杯质量的方法估算滤液的体积。
8.2.2 沉淀：将滤液加入4倍体积预热60°C的95%乙醇，或取80g滤液加入320mL预热60°C的95%乙醇室温下沉淀1小时。
8.2.3 过滤：在干燥的坩埚中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，记录坩埚的质量（精确到0.1mg）。用15mL 78%乙醇将硅藻土润湿，并用真空溶剂过滤装置在抽真空条件下，使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的坩埚中，抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。
8.2.4 洗涤：分别用15mL 78%乙醇、15mL 95%乙醇和15mL丙酮洗涤残渣各两次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土），精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。
8.2.5 蛋白质和灰分测定：称完质量的残渣和硅藻土的混合物，一份用凯氏定氮法，以N×6.25为换算系数，计算蛋白质质量，另一份在525°C灰化5小时，于干燥器中冷却，精确称量坩埚总量（精确至0.1mg）减去坩埚和硅藻土干重，计算灰分质量。
8.3 总膳食纤维检测检测
8.3.1 沉淀：在每份试样中加入预热至60°C的95%乙醇225mL（预热后的体积，如乙醇的温度超过65°C，则加入228mL），乙醇与样液体积比为4：1，取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1小时。建议改为：称量酶解液的质量，用天平加入4倍质量的预热的60°C的95%乙醇，4°C冰箱中沉淀过夜。
8.3.2 过滤：在干燥的坩埚中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，记录坩埚的质量（精确到0.1mg）。用15mL 78%乙醇将硅藻土润湿，并用真空溶剂过滤装置在抽真空条件下，使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的坩埚中，抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。
8.3.3 洗涤：分别用15mL 78%乙醇、15mL 95%乙醇和15mL丙酮洗涤残渣各两次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣和硅藻土），精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。
8.3.4 蛋白质和灰分测定：称完质量的残渣和硅藻土的混合物，一份用凯氏定氮
法，以N×6.25为换算系数，计算蛋白质质量。，另一份在525°C灰化5小时，
于干燥器中冷却，精确称量坩埚总量（精确至0.1mg）减去坩埚和硅藻土
干重，计算灰分质量。

9. 计算：

DF（%）=『（R1+R2）/2-p-A-B』/『（M1+M2）/2』*100%
式中：
DF=样品中膳食纤维含量（TDF、IDF、SDF），%
R1 和R2=双份样品残渣的质量，单位为毫克（mg）
m1 和m2=双份样品的质量，单位为毫克（mg）
A=灰分的质量，
P=蛋白的质量
B=空白=(BR1+BR2）/2-BP-BA
BR1 和BR2=双份试样空白残渣的质量
BP=试样空白蛋白的质量
BA=试样空白灰分的质量
可以使用该的计算软件Mega-CalcTM进行自动计算。
方法二
根据AACC method 32-05 和AOAC Method 985.29方法测定

1. 仪器设备和同方法一
2. 试剂和溶液
3. 280±2.0 mL 95 %乙醇

b．10±0.5 mL 78 %乙醇

1. 50±0.5 mL缓冲液
2. 磷酸盐缓冲液（0.08mol/L，PH值6.0）: 取1.400g Na2HPO4和9.68g NaH2PO4

溶解在700mL蒸馏水中，用水定容到1L，用PH计检查PH值。

1. 氢氧化钠溶液（0.275mol/L）：去11g氢氧化钠溶解在700mL蒸馏水中，冷却转

移到容量瓶中，用水定容到1L。

1. 盐酸溶液（0.325 mol/L）：取 325 mL 1.0 mol/L 盐酸置于容量瓶中，用水定容

到1L。

3. 样品准备

总膳食纤维的测定必须是低脂或无脂的干燥样品，取混匀后的样品于70°C真
空干燥过夜，干燥器中冷却，再称重记录重量损失，干样粉碎后过0.3-0.5 mm
筛，若试样不能加热，则冷冻干燥后再粉碎过筛。如果是高脂肪样品(> 10 %)，
取经过干燥的样品分别用25mL石油醚脱脂三次，干燥后记录脱脂的质量损失，
最后计算总膳食纤维含量时进行进行校正，粉碎过筛后的干燥试样放在干燥
器中待用。

4. 分析步骤

准确称取双份试样各1 g，质量差小于0.005g，精确到0.1mg，置于400mL或
600mL高型烧杯中，同时制备双份空白样，在每个烧杯中加入50 mL PH值6.0
的磷酸盐缓冲液，磁力搅拌，直到试样完全分散到缓冲液中，控制PH值6.0±0.1。
4.2 热稳定a-淀粉酶酶解：加入50 μL热稳定a-淀粉酶溶液，加盖铝箔，置于沸腾
水浴中15分钟，每5分钟轻轻振荡一次。当烧杯内的温度到100°C开始计时，
总共大约30分钟。
4.3 冷却：将烧杯取出冷却到室温，加入10 mL 0.275mol/L 的氢氧化钠，调节
PH值在7.5±0.1。
4.4 蛋白酶酶解：在每个烧杯中各加入100 μL蛋白酶溶液，加盖铝箔，置于60°C
恒振荡水浴中，当烧杯温度达到60°C开始计时，持续反应30分钟。
4.5 冷却：加入10 mL 0.325 mol/L盐酸，调节PH值在4.5±0.2。
4.6 淀粉葡萄糖苷酶酶解：在上述溶液中边搅拌边加入200 μL淀粉葡萄糖苷酶溶
液，加盖铝箔，置于60°C恒温振荡水浴中，持续振摇，当烧杯内温度达到60°C
开始计时，反应20分钟。
4.7 在每份试样中加入预热至60°C的95%乙醇280mL（预热前的体积），乙醇与样
液体积比为4：1，取出烧杯，盖上铝箔，室温下沉淀1小时。
4.8 过滤：在干燥的坩埚中加入1g硅藻土，70°C真空干燥至恒重，记录坩埚的质
量（精确到0.1mg）。用15mL 78%乙醇将硅藻土润湿，并用真空溶剂过滤装置
在抽真空条件下，使硅藻土平铺于坩埚中。将样品酶解液缓慢转移至对应的
坩埚中，抽滤。用刮勺和78%乙醇将所有残渣转至坩埚中。
4.9 洗涤：分别用20mL 78%乙醇洗涤3次、10mL 95%乙醇和10mL丙酮洗涤残渣
各两次，抽滤去除洗涤液后，将坩埚连同残渣在105°C烘干过夜或70°C真空
干燥过夜。将坩埚置于干燥器中冷却1小时，称重（包括坩埚、膳食纤维残渣
和硅藻土），精确至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣质量。
4.10 蛋白质和灰分测定：称完质量的残渣和硅藻土的混合物，一份用凯氏定
氮法，以N×6.25为换算系数，计算蛋白质含量。另一份在525°C灰化5小时，
于干燥器中冷却，精确称量坩埚总量（精确至0.1mg）减去坩埚和硅藻土干重，
计算灰分质量。
计算：
未校正的平均空白残渣 (UABR)=平均试样空白残渣质量，单位为毫克
未校正空白蛋白残渣(BPR)=UABR x %空白蛋白/100
未校正空白灰分残渣(BAR)=UABR x %空白灰分/100
校正的空白(CB)= UABR – BPR – BAR
未校正的平均样品残渣 (USAR)=平均试样空白残渣质量，单位为毫克
未校正样品蛋白残渣(SPR)=UABR x %空白蛋白/100
未校正样品灰分残渣(SAR)=UABR x %空白灰分/100
校正的样品(CSR)= USAR-SPR-SAR-CB% TDF= 100 x CSR/样品质量mg最终的% TDF是去除了和水分后的总膳食纤维含量。
10、参考文献：

1. Association of Official Analytical Chemists (1985). Official Methods of Analysis, 14th ed., 1st suppl. Secs. 43, A14-43,A20, p.399.
2. Association of Official Analytical Chemists (1986). Changes in methods. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 69:370.
3. Association of Official Analytical Chemists (1987). Changes in methods. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70:393.
4. Prosky, L., Asp, N.-G., Furda, I., DeVries, J.W., Schweizer, T.F.and Harland, B.F. (1985). Determination of total dietary fibre in foods and food products: Collaborative study. J. Assoc. Off. Anal.Chem., 68:677.
5. Prosky, L., Asp, N.-G., Schweizer, T.F., DeVries, J.W. and Furda,I. (1988). Determination of insoluble, soluble, and total dietary fibre in

foods and food products. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71:1017.16